Ligering Kalkulator

Kategori: Biologi
- maj 10, 2025
| |

Vektor DNA

Insert DNA

Ligasjons Reaksjonsoppsett

Anbefalt Insert Mengde
8.3 ng
0.33 μL av insert lager
Vektor Mengde
50 ng
Bruker 1 μL av vektor lager
Insert:Vektor Forhold
3:1 (molar)
Optimal for standard kloning

Fullstendig Reaksjonsoppsett

Komponent Volum (μL) Endelig Mengde
Vektor DNA (50 ng/μL) 1.0 50 ng
Insert DNA (25 ng/μL) 0.33 8.3 ng
10× T4 DNA Ligase Buffer 2.0 1×
T4 DNA Ligase 1.0 400 U
Nuklease-fri Vann 15.67 Til 20 μL
Total Volum 20.0

Optimaliseringstips

Basert på dine inndata, her er noen anbefalinger:

  • For 5' klistrete ender med et vektor:insert forhold på 1:3, inkuber ved 16°C i 4 timer.
  • CIP-behandling av vektoren vil bidra til å redusere selv-ligasjons bakgrunn.
  • Hvis transformasjons effektiviteten er lav, prøv å øke insert:vektor forholdet til 5:1.
  • For blunt end ligasjoner, øk ligase konsentrasjonen og forleng ligasjons tiden.
  • Varm inaktiver ligasen ved 65°C i 10 minutter før transformasjon for best resultat.

Om DNA Ligasjon

  • DNA ligasjon involverer sammenføyning av DNA fragmenter gjennom dannelse av fosfodiesterbindinger.
  • T4 DNA ligase krever ATP og Mg²⁺ for å fungere skikkelig (tilveiebrakt i ligasjonsbufferen).
  • Klistrete end ligasjoner er mer effektive enn blunt end ligasjoner.
  • Vektor:insert molarforhold varierer vanligvis fra 1:3 til 1:5 for standard kloning.
  • Høyere insert:vektor forhold (3:1 til 10:1) anbefales for blunt end ligasjoner eller større inserts.
  • Dephosphorylering av vektorer (ved bruk av CIP, SAP, osv.) forhindrer vektor selv-ligasjon.
  • Rask ligase systemer kan redusere ligasjons tiden til 5-15 minutter ved romtemperatur.

Formel for innsatt mengde (ng):

\[ \text{Innsatt ng} = \left( \frac{\text{Vektor ng} \times \text{Innsatt størrelse i kb}}{\text{Vektor størrelse i kb}} \right) \times \left( \frac{\text{Innsatt mol}}{\text{Vektor mol}} \right) \]

Hva er ligasjonskalkulatoren?

Ligasjonskalkulatoren er et verktøy som hjelper forskere med å bestemme riktig mengde vektor og innsatt DNA som trengs for en vellykket ligasjonsreaksjon. DNA-ligering er et kritisk trinn i molekylær kloning, der et DNA-innsatt settes sammen med en plasmidvektor ved hjelp av et enzym kalt DNA-ligase.

Hvordan fungerer det?

Denne kalkulatoren lar brukere legge inn detaljer om vektoren og innsatt DNA, inkludert lengde og konsentrasjon. Basert på det valgte molarforholdet beregner den den nødvendige mengden innsatt DNA for å oppnå en optimal ligasjonsreaksjon.

Nøkkelfunksjoner

  • Beregner vektor-til-innsatt molarforhold for ulike kloningsscenarier.
  • Støtter både standard og tilpassede molarforhold.
  • Gir anbefalinger for ligasjonsbetingelser basert på sticky- eller blunt-end-kloning.
  • Inkluderer optimaliseringstips for å forbedre ligasjonseffektiviteten.

Hvordan bruke kalkulatoren

  1. Angi vektorlengde (bp) og konsentrasjon (ng/μL).
  2. Angi innsatt lengde (bp) og konsentrasjon (ng/μL).
  3. Velg ønsket vektor-til-innsatt molarforhold (f.eks. 1:3, 1:5).
  4. Spesifiser total reaksjonsvolum (f.eks. 20 μL).
  5. For avanserte innstillinger, velg ligasjonstemperatur, varighet, ligasetype og vektorbehandlingsalternativer.
  6. Klikk på "Beregn" for å generere anbefalt innsatt mengde og reaksjonsoppsett.

Vanlige spørsmål

Hva er det optimale vektor-til-innsatt molarforholdet?

For sticky-end-ligeringer anbefales generelt et 1:3- eller 1:5-vektor-til-innsatt-forhold. For blunt-end-ligeringer kan et høyere forhold (f.eks. 1:5 til 1:10) forbedre effektiviteten.

Hvorfor anbefales vektordefosforylering?

Defosforylering (ved bruk av CIP, SAP eller Antarctic Phosphatase) forhindrer selv-ligering av vektoren, noe som reduserer uønskede bakgrunnskolonier.

Hvilke ligasjonsbetingelser bør jeg bruke?

  • 16°C i 4 timer – Standardbetingelse for T4 DNA-ligase.
  • Romtemperatur i 15 minutter – Egnet for Quick Ligase.
  • Over natten ved 16°C – Anbefales for utfordrende ligeringer eller blunt-end-kloning.

Hvordan kan jeg forbedre ligasjonseffektiviteten?

  • Sørg for riktig molarforhold for vektor og innsatt.
  • Bruk fersk DNA-ligase og buffer.
  • Optimaliser ligasjonsbetingelsene (temperatur og varighet).
  • Bekreft tilstedeværelsen av innsatt DNA via gelelektroforese før ligering.

Hvorfor bruke denne kalkulatoren?

Denne ligasjonskalkulatoren forenkler oppsettet av DNA-ligasjonsreaksjoner, og hjelper forskere med å bestemme riktige mengder vektor og innsatt for effektiv kloning. Ved å automatisere beregninger og tilby optimaliseringstips sparer den tid og øker suksessraten for ligasjonseksperimenter.